用户文章Nature Cell Biol：ATG8与自噬因子IRGM调控TFEB

论文标题：Mammalian Atg8 proteins and the autophagy factor IRGM control mTOR and TFEB at a regulatory node critical for responses to pathogens

刊登日期：2020年8月

发表杂志：Nature Cell Biology

影响因子：20.042

研究机构：新墨西哥大学&奥斯陆大学&莫纳什大学

开展项目：转录组测序

摘要

在哺乳动物细胞中，自噬是一个具有多种功能的动态平衡过程。

在本文中，联川生物客户，来自新墨西哥大学的Deretic课题组发现哺乳动物的Atg8蛋白(MAtg8s)和自噬调节因子IRGM控制着溶酶体系统的转录激活因子TFEB。

IRGM直接与TFEB相互作用，出核转运。

IRGM的mAtg8 partner——GABARAP与TFEB互作。

所有mAtg8或GABARAP的缺失影响了细胞中整体对饥饿胁迫的转录反应，并使得TFEB下游的靶基因下调。

IRGM和GABARAPs作为TFEB负调控因子能够影响 mTOR活性。这被mTOR的激活剂RagB抑制。巨噬细胞感染结核分枝杆菌或HIV后，均以IRGM诱导TFEB活化。

因此，IRGM及其相互作用因子mAtg8s关闭了自噬途径和TFEB控制溶酶体生物发生之间的环路，从而确保了两个系统的协调激活，这两个系统最终在自噬过程中合并。

IRGM影响TFEB的核转运

IRGM影响TFEB在亚细胞分布，IRGM敲低减少了饥饿胁迫条件下TFEB核移位以及对mTOR 抑制剂的反应。

IRGM敲除KO小鼠中原代骨髓来源的巨噬细胞也证实了以上现象与结论。

IRGM与TFEB直接互作

GFP-IRGM与FLAG-TFEB进行co-IP，GFP-IRGM与内源性TFEB共定位，GST pulldown实验（包含特定结构域的Mut与WT补救验证）等一系列试验证实，IRGM与MITF/TFE成员互作并直接结合TFEB

IRGM介导TFEB磷酸化修饰并影响mTOR活性

过表达IRGM引起内源性TFEB电泳迁移率增加，引起TFEB磷酸化修饰程度降低。

TFEB被mTOR 磷酸化。使用mTOR 催化抑制剂pp242处理后，TFEB水平下降。反之过表达IRGM可降低mTOR 活性。

IRGM敲低减弱了细胞饥饿胁迫处理期间mTOR 从溶酶体中的去吸附/解吸附作用（desorption），但奇怪的是mTOR 与溶酶体结合增加。

IRGM稳定并激活AMPK，而AMPK抑制mTOR活性。IRGM敲低后降低AMPK活性以响应饥饿胁迫。

因此，IRGM激活AMPK可能影响mTOR的基础状态。作者进行一系列实验证实IRGM至少部分通过mTOR影响TFEB的激活。

IRGM与钙调节神经磷酸酶PPP3CB互作
 

通过对IRGM进行敲低、GST pulldown、co-IP，以及利用纯化的溶酶体进行LysoIP技术证实，IRGM与PPP3CB互作，并且增强了TFEB与PPP3CB的关联。

IRGM过表达还促进了PPP3CB另一个靶蛋白NFAT的去磷酸化修饰。

综上所述，IRGM不仅通过mTOR 控制TFEB，还能通过PPP3CB起作用。

ATG8s调控TFEB出核转运

已知IRGM能与ATG8形成蛋白复合物。在排除了LDS-LIR经典互作模式情况下，co-IP证实GABARAP与TFEB直接互作。

接着作者在HeLa细胞中对ATG8进行三种不同的敲除（LC3A/LC3B/LC3C-KO）后发现，MIFT在饥饿胁迫下核转运减少。

仅仅采用第三种LC3C敲除方式不影响TFEB转运。但当整体GABARAP进行敲除后，TFEB出核转运出现降低。

同时KO的HeLA细胞中，外源性转入GABARAP后的补救实验也证实了这个现象。

与WT野生型HeLa细胞相比，LC3C的KO细胞只是部分降低TFEB出核转运效率，这可能与mTOR 相关。后续实验证实三种KO都抵消了饥饿诱导的mTOR活性抑制。

因此IRGM和GABARAP对TFEB的影响都聚焦于于mTOR的相似通路。

ATG8对TFEB靶基因表达的影响

TFEB具有转录调控功能。作者对饥饿诱导的Atg8 KO HeLa细胞(HexaKO)及其亲本HeLa细胞进行了转录组测序（由联川生物提供建库与生信分析）。

与亲本HeLa细胞相比，HexaKO细胞中有451个基因下调，包括46个先前确定的TFEB靶基因。

靶基因中由溶酶体水解酶和其他已鉴定的TFEB靶基因组成，如CTSB、CTSF、CTSZ、GUSB、HEXA和TPP1，以及MMP12、FOLR1、AHNAK2、HLA-B、HOXB9、HKDC1、LPAR5和SCPEP1。

相对于HexaKO细胞，GABATKO细胞显示出部分重叠。在GABATKO细胞中，其他TFEB靶基因如Dexi、VPS18、SYNJ2、SFXN3、APBB3、HSPB8和关键的自噬调节因子ULK1都出现了表达降低。

但是这些变化是由于禁用的自噬还是由于mAtg8的其他效应器功能造成的呢？

接下来作者非常巧妙地使用了ATG3 KO细胞来进行验证后发现，与HexaKO仅发现11个TFEB重叠的靶基因，并进行了qPCR 验证。

HexaKO中TFEB虽然没有很大幅度改变，但是蛋白水平确实出现了变化，这表明ATG8可能影响TFEB的蛋白水平。

综上所述，ATG8影响所有基因的转录活性，包括溶酶体相关mRNA。这涉及到与TFEB领域和其他有待充分探索的系统的影响出现了部分重叠。

ATG8影响不同基因出现差异表达

转录组测序结果还表明，HexaKO细胞的测序结果中包括294个基因的上调，这些变化不仅仅是由TFEB引起的。

转录组差异分析表明，NFATC和其他钙效应因子如CAMK2N1、CANA2D3、ORAI3和PLCG2的表达发生了变化，这表明了一个与Ca2+相关调控方向可能也在起作用。

作者特意证实了HexaKO细胞在HBSS中饥饿的细胞的胞浆Ca2+增加减少。

因此，除了在TFEB刺激途径中与PPP3CB的特异性相互作用和对TFEB依赖的转录的影响外，ATG8还影响胞浆中的Ca2+反应。

Stx17控制TFEB出核转运

IRGM和mAtg8s之间复合体的另一个成员是Stx17。基于Stx17 CRISPR的KO(Stx17KO)细胞对饥饿的反应显示TFEB向细胞核的转位减少。通过LysoIP、pulldown等一系列实验证实，Stx17与TFEB互作并将磷酸化的TFEB固定在胞浆中（同时得到质谱验证）。

Stx17影响饥饿中mTOR 抑制

由于IRGM和mAtg8都是有效抑制饥饿反应中mTOR所必需的，作者还在Stx17KO HeLa细胞中进行测试。饥饿反应中mTOR的失活减少，S6K和ULK1的持续磷酸化和溶酶体上mTOR的存在证明了这一点。

RAGA和RAGB通过同源核苷酸交换因子(Gef)的作用在生理上被激活并装载有GTP，该因子是一个被称为Ragator的五聚体复合物，由LAMTOR1-5等组成。

在氨基酸饥饿期间，刺激器-RAG相互作用增强，这是一种效应这被认为反映了GEF对不活跃的同源GTP酶，如Rags的亲和力增加。

作者使用Ragator-RAG相互作用作为Stx17 KO的细胞中RAGA激活状态。Stx17KO HeLa细胞显示出低于Stx17 WT HeLa细胞的RAGA-p18复合物，这与RAGA活化状态的增加一致。与WT HeLa细胞相比，在Stx17KO中观察到RAGA与其效应器Raptor的相互作用增加。

因此，Stx17影响激活mTOR的关键Rag GTPase的状态。

IRGM在病理条件下影响TFEB出核转运

作者测试了生理条件下感染的巨噬细胞IRGM对TFEB影响，TFEB定位于细胞核。

作者还对IRGM上c313C（miR-196靶点）进行测试。已知c313T不是miR-196的靶点，作者进行miR-196转染实验后发现，IRGM降低表达后减少了TFEB出核转运能力。

因此，IRGM等位基因c313C似乎与适度的TFEB反应有关，并抑制过度活跃的反应。

NEF是参与艾滋病发病机制的HIV辅助因子，在TFEB的核易位中起着复杂的作用。当作者用编码Nef的假型HIV病毒感染细胞时，这诱导了TFEB相对于慢病毒载体对照的核转位，而敲低IRGM基本上逆转了TFEB的核转位。

因此，IRGM控制TFEB的核转位，以响应各种病理应激源。

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